Fluorescenčná mikroskopia je výkonná technika, ktorá umožňuje výskumníkom vizualizovať špecifické molekuly a štruktúry v bunkách a tkanivách. Na prípravu vzoriek na fluorescenčnú mikroskopiu sa často používa kryostatický mikrotóm na rezanie tenkých rezov zmrazeného tkaniva. V tomto blogovom príspevku sa podelím o niekoľko postrehov o tom, ako používať kryostatový mikrotóm na fluorescenčnú mikroskopiu, pričom vychádzam zo svojich skúseností dodávateľa kryostatového mikrotómu.
Pochopenie kryostatového mikrotómu
Kryostatový mikrotóm je špecializovaný nástroj určený na rezanie tenkých rezov zmrazeného tkaniva pri nízkych teplotách. Pozostáva z rezacieho noža, držiaka vzorky a komory s regulovanou teplotou. Nízka teplota pomáha zachovať štruktúru tkaniva a zabrániť degradácii fluorescenčných molekúl.
Na trhu sú dostupné rôzne typy kryostatových mikrotómov. Napríklad,Kryotómponúka presné možnosti rezania, pričomPoloautomatické kryostatyposkytuje dobrú rovnováhu medzi automatizáciou a užívateľským ovládaním. nášMikrotóm kryostatukombinuje pokročilé funkcie, aby vyhovovali rôznym potrebám výskumníkov.
Príprava kryostatového mikrotómu
Pred použitím kryostatového mikrotómu je nevyhnutné správne pripraviť nástroj. Najprv očistite rezaciu čepeľ a držiak vzorky, aby ste odstránili všetky nečistoty alebo nečistoty. Na dôkladné vyčistenie použite vhodný čistiaci roztok a mäkkú kefku.
Ďalej nastavte teplotu komory kryostatu. Ideálna teplota závisí od typu rezaného tkaniva. Vo všeobecnosti je teplota medzi -18°C a -25°C vhodná pre väčšinu tkanív. Pred pokračovaním nechajte kryostat dosiahnuť nastavenú teplotu.
Príprava vzorky tkaniva
Pre úspešnú fluorescenčnú mikroskopiu je rozhodujúca kvalita prípravy vzorky tkaniva. Začnite fixáciou tkaniva vo vhodnom fixačnom prostriedku. Pre fluorescenčnú mikroskopiu sa bežne používajú fixačné prostriedky, ako je paraformaldehyd, pretože dobre zachovávajú fluorescenčné signály.
Po fixácii má byť tkanivo kryoprotektívne. To zahŕňa ponorenie tkaniva do roztoku kryoprotektantu, ako je sacharóza, aby sa zabránilo tvorbe ľadových kryštálikov počas zmrazovania. Tkanivo sa potom zmrazí vo vhodnom mraziacom médiu, ako je napríklad zlúčenina OCT.
Upevnenie tkaniva na držiak vzorky
Keď je tkanivo zmrazené, je potrebné ho namontovať na držiak vzorky. Opatrne umiestnite blok zmrazeného tkaniva na držiak vzorky a zaistite ho pomocou vhodného montážneho zariadenia. Uistite sa, že tkanivo je vycentrované a pevne pripevnené k držiaku, aby ste zabezpečili presné rezy.
Nastavenie parametrov rezu
Pred spustením procesu krájania nastavte parametre krájania na mikrotóme kryostatu. Medzi tieto parametre patrí hrúbka rezu, rýchlosť rezania a rýchlosť posuvu. Hrúbka rezu závisí od typu tkaniva a požiadaviek na experiment fluorescenčnej mikroskopie. Pre väčšinu aplikácií je vhodná hrúbka profilu 5 - 10 mikrometrov.
Rýchlosť rezania a rýchlosť posuvu je potrebné upraviť na základe tvrdosti tkaniva. Mäkšie tkanivá môžu vyžadovať nižšiu rýchlosť rezania a menšiu rýchlosť posuvu, zatiaľ čo tvrdšie tkanivá môžu tolerovať vyššiu rýchlosť rezania.
Rozdelenie tkaniva
Po nastavení parametrov spustite proces rezania. Pomaly posúvajte držiak vzorky smerom k rezacej čepeli. Keď čepeľ prerezáva tkanivo, vytvoria sa tenké rezy. Pomocou jemnej kefy alebo zdvíhača sekcií opatrne preneste sekcie na podložné sklíčko.
Je dôležité zaobchádzať s časťami jemne, aby ste predišli poškodeniu. Uistite sa, že sekcie sú na sklíčku rovnomerne rozložené a neprekrývajú sa.
Fluorescenčné farbenie rezov
Po narezaní je ďalším krokom zafarbenie rezov fluorescenčnými farbivami. Pre rôzne aplikácie sú dostupné rôzne fluorescenčné farbivá, ako napríklad DAPI na farbenie jadier a farbivá Alexa Fluor na špecifické značenie proteínov.
Pripravte farbiaci roztok podľa pokynov výrobcu. Inkubujte rezy v farbivom roztoku počas vhodnej doby. Po zafarbení rezy dôkladne umyte, aby ste odstránili prebytočné farbivo.
Montáž zafarbených sekcií
Keď sú sekcie zafarbené, je potrebné ich namontovať na krycie sklíčko. Použite vhodné montážne médium, ktoré je kompatibilné s fluorescenčnými farbivami. Naneste kvapku montážneho média na zafarbené časti a opatrne spustite krycie sklíčko na podložné sklíčko, aby ste zabránili tvorbe vzduchových bublín.
Zobrazovanie sekcií
Nakoniec sú zafarbené rezy pripravené na fluorescenčnú mikroskopiu. Umiestnite sklíčko na stolík mikroskopu a upravte zaostrenie a zväčšenie, aby ste vizualizovali fluorescenčné signály. Na detekciu rôznych fluorescenčných farbív použite vhodné filtre.
Riešenie problémov a tipy
- Sekcia Kvalita: Ak sú časti pokrčené alebo roztrhané, skontrolujte, či rezný kotúč nie je otupený alebo poškodený. Na výrobu vysoko kvalitných rezov je nevyhnutná ostrá čepeľ.
- Fluorescenčný signál: Ak je fluorescenčný signál slabý, skontrolujte protokol farbenia. Uistite sa, že čas farbenia a koncentrácia farbiva sú primerané. Tiež sa uistite, že rezy nie sú premyté, pretože to môže znížiť fluorescenčný signál.
- Regulácia teploty: Udržujte stabilnú teplotu v komore kryostatu počas celého procesu krájania. Kolísanie teploty môže ovplyvniť kvalitu sekcií.
Kontakt pre nákup a konzultáciu
Ak máte záujem o kúpu kryostatického mikrotómu pre potreby fluorescenčnej mikroskopie, alebo ak máte akékoľvek otázky týkajúce sa jeho použitia, neváhajte nás kontaktovať. Náš tím odborníkov je pripravený pomôcť vám nájsť ten správny nástroj pre váš výskum.
Referencie
- Histológia: Text a atlas od Michaela H. Rossa a Wojciecha Pawlinu.
- Fluorescenčná mikroskopia: princípy, techniky a aplikácie od Richarda P. Hauglanda.